Abstract
Sammendrag
Transkripsjonsfaktorer har en viktig rolle i normale cellefunksjoner, men har også vist seg å være involvert i kreftutvikling. Transkripsjonsfaktoren c-Myb spiller en betydelig rolle i hematopoiesen hvor den er involvert i kontroll av celledeling og spesialisering av ulike blodceller. Deregulering av c-Myb s nivå eller aktivitet antas å ha betydning ved utvikling av blodkreft. Aktiviteten av c-Myb reguleres hovedsakelig gjennom posttranslasjonelle modifikasjoner samt interaksjoner med ko-aktivatorer og ko-repressorer. Kovalente modifikasjoner, som fosforylering, acetylering, og ubiquitinering, antas å styre c-Myb s preferanser for interaksjonspartnere. Sumoylering er et eksempel på en kovalent modifikasjon som har blitt vist å påvirke aktiviteten til c-Myb. SUMO (small ubiquitin-like modifier) er et 100 aa stort peptid som bindes kovalent til lysinet i konsensussekvensen KXE. c-Myb inneholder to slike sumoyleringsseter i sitt negativt regulatoriske domene (NRD), og modifiseres av SUMO i begge setene (K503 og K527). Mutasjon av disse SUMO-akseptor lysinene (KR) eliminerer SUMO-modifikasjon og medfører en dramatisk økning av c-Myb s transkripsjonelle aktivitet.
Lysinresiduer kan bli modifisert på mange ulike måter; acetylering, ubiquitinering og metylering er noen eksempler. På bakgrunn av dette var et av målene med denne oppgaven å undersøke om de store funksjonelle effektene av KR mutasjonene i c-Myb kun skyldtes tapt SUMO-konjugering, eller om andre lysindirigerte modifikasjoner også kunne være medvirkende. Dette ble gjort ved å lage nye mutanter som også forhindrer sumoylering, men uten å endre SUMO-akseptor lysinene (EA). Uttesting av EA mutantene viste hovedsakelig det samme transaktiverings- og modifiseringsmønster som de tilsvarende KR mutantene, noe som tyder på at tapt sumoylering er den viktigste årsaken til den økte aktiviteten hos sumoyleringsmotivmutantene.
Ubalanse i sumoyleringssyklusen er funnet å ha betydning ved ulike sykdomsprosesser, og det ville derfor være interessant å kunne måle ulike celler og cellelinjers sumoyleringsaktivitet ved bruk av en egnet SUMO-sensor. Ulik grad av sumoylering ville da kunne avspeile eventuell ubalanse i SUMO-apparatet. c-Myb s NRD har evnen til å skifte fra et repressivt til et aktiverende domene avhengig av sumoyleringsstatus, og dette domenet er derfor en potensiell kandidat til utvikling av en slik SUMO-sensorsystem.
For å undersøke om NRD av c-Myb, med de to sumoyleringsmotivene, kunne fungere som en SUMO-sensor ble det konstruert GAL4DBD-NRD fusjonskonstrukter med tilsvarende EA mutasjoner som for fullengde konstruktene. GAL4DBD-NRD EA og KR konstrukter ble sammenlignet, og alle konstruktene ble i tillegg testet under ulike aktivitetsmodulerende forhold, relatert både til sumoylering og ubiquitineringsapparatet.
Forsøk utført i denne oppgaven viste at GAL4-NRD konstruktene (SUMO-sensoren) kan registrere endringer i SUMO-apparatet i form av desumoylering. Men det ble i tillegg også funnet at SUMO-sensorsystemet responderer på endringer i ubiquitineringsapparatet. Mulige løsninger på denne problematikken diskuteres. Det ble i denne forbindelse også gjort observasjoner som viste at usumoylert c-Myb-NRD har egenskaper som et klassisk transaktiveringsdomene (TAD), noe som antyder at NRD kan fungere som et betinget, SUMO-regulert TAD. Ved uttesting av SUMO-sensoren i prostatakreftcellelinjen LNCaP, som har et forhøyet uttrykk av SUMO-proteasen SENP1, var disse endringene målbare med sensoren. Dette gir håp om at SUMO-sensorsystemet, ved innføring av visse kriterier, kan være et brukbart verktøy for måling av forandringer i SUMO-apparatet.