Abstract
Proteiner har i nyere tid fått en økt interesse som biomarkører for progresjon av sykdomsforløp, effekt av terapeutiske intervensjoner og doping. Dette har skapt et behov for analyseteknikker med høy nøyaktighet og sensitivitet som kan detektere små mengder protein i kompliserte matrikser. I denne oppgaven ble det karakterisert et nytt konsept for bestemmelse av proteiner, i form av papir-basert immunoekstraksjon etterfulgt av analyse med LC-MS/MS. Glykoproteinet humant koriongonadotropin (hCG) ble brukt som modellanalytt under denne oppgaven. Bestemmelse hCG ble først undersøkt ved bruk av immunoekstraksjon på voksprintet filterpapir med adsorbert antistoff, med påfølgende ekstraksjon og massespektrometrisk deteksjon. Sammenlignet med in-solution analyser resulterte denne metoden i lave signaler for hCG, og en høy grad av uspesifikk binding av hCG til analysepapiret. Bruken av blokke- buffer og ulike vaskevolum etter prøvepåsetting ble undersøkt i et forsøk på å redusere graden av uspesifikke interaksjoner. Ulike konsentrasjoner av BSA som blokke-buffer hadde liten innvirkning på graden av uspesifikke interaksjoner, men det ble vist en reduksjon i signal for hCG ved økende mengder vaskeløsning, potensielt som følge av at uspesifikt tilkoblet hCG ble vasket bort fra papiret. Totalt sett ble denne metoden vurdert å ha flere utfordringer, men potensiale som analyseteknikk. En metode for bestemmelse av hCG basert på immunoekstraksjon med kovalent immobilisert antistoff på polymerisert filterpapir, etterfulgt av ekstraksjon og massespektrometrisk deteksjon ble undersøkt. Filterpapir polymerisert med HEMA ble enten ko-polymerisert med VDM eller syntetisert med TSCl for å danne «ankerpunkter» for kovalent immobilisering av antistoff. Ved denne tilnærmingen ble det observert en betydelig høyere signalintensitet for hCG og redusert grad av uspesifikk binding av hCG til papiret, sammenlignet med første undersøkte metode for bestemmelse av hCG. En konsentrasjonskurve for hCG ble undersøkt i serum for alle typer papir, som viste god korrelasjon mellom signalintensitet for hCG og undersøkt hCG-konsentrasjon for både HEMA-VDM- (R2 = 0,996) og HEMA-TSCl-polymerisert papir (R2 = 0,999). Sammenlignet med de to typene polymerisert papir, ga ubehandlet filterpapir opphav til en omtrentlig 7 ganger lavere signalintensitet for hCG, og noe dårligere korrelasjon (R2 = 0,965). Sammenlignet med konsentrasjonskurver for hCG i mindre kompliserte matrikser kunne man for begge typene polymerisert papir se en betydelig nedgang i graden av uspesifikke interaksjoner mellom hCG og papiret. Det ble med dette konkludert at beste ytelse i relasjon til immunoekstraksjon og deteksjon av hCG i serum ble oppnådd ved bruk av polymerisert filterpapir med kovalent immobilisert antistoff.