Abstract
Parallel artificial liquid membrane extraction (PALME), beskrevet første gang i 2013, representerer et nytt konsept for mikroekstraksjon. Det er et trefase-system med et ekstraksjonsprinsipp basert på væske-væske-ekstraksjon (liquid-liquid-extraction, LLE). Teknikken utføres i et 96-brønnsformat, med en organisk væskemembran immobilisert i et PVDF-filter mellom en donorplate og en akseptorplate. Analyttene ekstraheres fra vandige prøver i donorbrønnen, over den organiske væskemembranen, og til en akseptorløsning som er egnet for det utvalgte analyseinstrumentet. Fordeler som lavt løsemiddelforbruk, god opprensning og mulighet for automatisering gir potensial for utvikling av nye ekstraksjonsmetoder ved bruk av PALME for ulike stoffgrupper. PALME har vært benyttet til analyse av en rekke legemidler med sure og basiske egenskaper, og ulike nye psykoaktive stoffer [1-3]. For å se om det var mulig å utvide med flere typer stoffer ble PALME av åtte basiske upolare rusgivende stoffer, samt elleve benzodiazepiner (og benzodiazepinlignende stoffer), undersøkt innledningsvis. Siden det viste seg at det optimaliserte PALME-systemet kunne være en god prøveopparbeidelsesmetode for benzodiazepiner ble det valgt å gå videre med denne stoffgruppen. Det ble testet 21 benzodiazepiner (og benzodiazepinlignende stoffer) i arbeidet. Følgende substanser ble inkludert: 7-aminoklonazepam, alprazolam, bromazepam, diazepam, deskloretizolam, diklazepam, etizolam, fenazepam, flubromazepam, flubromazolam, flunitrazepam, klonazepam, klonazolam, lorazepam, meklonazepam, midazolam, N-desmetyldiazepam, nitrazepam, oksazepam, zolpidem og zopiklon. I de siste årene har det vært et økende misbruk av nye typer benzodiazepiner. Dette gir større behov for nye metoder som gir rask og nøyaktig bestemmelse av stoffene. Fokuset i oppgaven var å utvikle en effektiv metode for ekstraksjon av benzodiazepiner fra fullblod og som kunne benyttes til kvantitativ anvendelse. Flere ekstraksjonsparametere ble optimalisert i arbeidet. Det ble testet syv ulike organiske løsemidler som organisk væskemembran, ulike ekstraksjonstider, ulike pH-betingelser i prøveløsning, samt akseptorløsninger med ulike sammensetninger. Ekstraksjon med fullblod som analysemedium ble undersøkt, og prøveopparbeidelsesmetoden ble deretter delvis automatisert ved bruk av en 96-kanalpipette. En vesentlig forbedring av ekstraksjonsutbytte ble sett ved tilsetning av dimetylsulfoksid (DMSO) i akseptorløsningen, og bruk av 96-kanalpipette ga en kraftig reduksjon av analysetiden. Den endelige prosedyren for ekstraksjon av benzodiazepiner ble utført ved å tilsette 100 µl fullblodprøve, 130 µl 50 mM fosfatbuffer med pH 7,5 og 20 µl internstandard i donorbrønnen. Det ble benyttet organisk væskemembran bestående av 4 µl undekanon blandet med diheksyleter i forholdet 1:1 (w/w) med 1 % trioktylamin (w/w). I akseptorbrønnen ble 150 µl DMSO blandet med 200 mM HCOOH i forholdet 75:25 (v/v) tilsatt. Platene ble satt sammen og topplaten ble forseglet. Oppsettet ble satt på risting i 60 minutter for å fremme ekstraksjonen. Analysen ble utført med ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS). Den optimaliserte metoden for ekstraksjon av benzodiazepiner ble validert etter retningslinjene for bioanalytisk metodevalidering fra det europeiske legemiddelbyrået (European Medicines Agency, EMA). Resultatet viste at metoden ga ekstraksjonsutbytte mellom 52-104 %, og flere stoffer fikk tilnærmet 100 % utbytte. Matrikseffekter er innenfor 15 % og oppfylte kravet. Linearitet basert på gjennomsnittsverdier fra seks paralleller av hver standard ga kalibreringskurver med R2-verdier på over 0,99 for alle stoffer. Linearitet beregnet for hver respons fra analyttene ga kalibreringskurver med noe lavere R2-verdi, fem av stoffene fikk da R2-verdier på over 0,98 og resten fikk R2-verdier på over 0,99. Nøyaktighet og presisjon ble validert med laveste kontrollnivå mellom 3,2 og 160 ng/ml, avhengig av stoff, og høyeste kontrollnivå 19 ganger høyere. RSD-verdier oppfylte kravene for alle konsentrasjonsnivåer, mens to stoffer fikk et noe større avvik for innen serie-nøyaktigheten på ett kontrollnivå. Metoden hadde lave deteksjonsgrenser som er mellom 0,1-5 ng/ml og lave kvantifiseringsgrenser som er i området 3,2-160 ng/ml. Stabilitetstesten viste at ekstraktene var holdbare i opp til fire dager ved 10°C og opptil ti dager ved -20°C. Noe overdrag ble observert etter injeksjon av svært høye konsentrasjoner. Det viste seg at PALME-metoden har ekstrahert benzodiazepiner (og benzodiazepinlignende stoffene) fra fullblod med tilfredsstillende resultater, og kan anvendes til både påvisning og kvantifisering av de undersøkte stoffene. Ekstraksjon av basiske upolare substanser fra vandige prøveløsninger har også vist gode resultater. PALME anses dermed å ha potensial for analyse av et større utvalg av stoffgrupper. Dette kan være av stor interesse innenfor det rettsmedisinske feltet.