| dc.description.abstract | Bacillus cereus–gruppen er en undergruppe av Bacillus slekten, og består av seks arter: B. cereus, B. anthracis, B. thuringiensis, B. mycoides, B. pseudomycoides og B. weihenstephanensis. B. anthracis foråsaker den dødelige sykdommen miltbrann, og er et potensielt biologisk våpen. B. thuringiensis produserer intracellulære krystaller og brukes kommersielt som biopesticid. B. cereus er en jordbakterie og opportunistisk patogen som er en vanlig årsak til to former for matforgiftningssyndromer: diaré–syndrom og emetisk syndrom.
Enkelte bakteriestammer i B. cereus gruppen kan danne biofilm. Biofilm kan defineres som samfunn av mikroorganismer festet til overflater som mineraler eller i grensen mellom luft/væske samt levende materialer som dyr og mennesker, og kan bestå av en eller flere arter av mikrober. Bakterier i biofilmer er beskyttet mot mekaniske påkjenninger, antimikrobielle forbindelser og det humane immunsystemet ved hjelp av en ekstracellulær matriks som omgir bakteriene og danner tredimensjonal arkitektur. Den ekstracellulære matriksen kan inneholde polysakkarider, proteiner, nukleinsyrer og fosfolipider. Biofilmrelaterte problemer kan for eksempel oppstå i medisin og i matindustrien.
Biofilmdannelse reguleres ved hjelp av mange faktorer, slik som intercellulær kommunikasjon gjennom «quorum sensing», samt intracellulære faktorer slik som «second messenger» system, eller reguleringssystemer på transkripsjonsnivå. Til de ekstracellulære faktorene hører blant annet tilgang på næring, og forskjellige fysiske og mekaniske signaler.
Bis–(3’–5’)– cyclic dimeric guanosine monophosphate (c–di–GMP) er et «second messenger» molekyl og spiller en viktig rolle i overgangen mellom bakteriens motile singel–cellulære tilstand og biofilmassosiert livsstil. c–di–GMP har vist seg å stimulere biofilmdannelse, redusere motilitet og påvirke ekspresjon av enkelte virulensgener. Høye c–di–GMP nivåer kan stimulere forskjellige biofilm–assosierte funksjoner: utviklingen av fimbrier, andre adhesiner og eksopolysakkarider. I tillegg kan c–di–GMP påvirke celle–syklus–progresjon.
c–di–GMP dannes fra to guanosine trifosfat–molekyler, ved hjelp av enzymer kalt diguanylat cyclaser som inneholder GGDEF domener. Kløyving av c–di–GMP katalyseres av to typer fosfodiesteraser, enzymer som inneholder EAL domener eller HD–GYP domener. Cdg135 fra B. thuringiensis 407 inneholder både et GGDEF og et EAL domene, har c–di–GMP–metaboliserende aktivitet, og biofilmdammelse er hemmet i en cdg135 delesjonsmutant.
BC1060 er et annotert adhesjonsmolekyl i B. cereus genomer, og har en domenestruktur som er typisk for såkalte MSCRAMM–familie proteiner, som kan være involvert i celle–celle interaksjoner og/eller binding til ekstracellulære matriks komponenter i humant vev, som for eksempel kollagen. BC1060–proteinet er vist å være involvert i biofilm–dannelse, ved at en BC1060–delesjonsmutant viser kraftig nedsatt evne til å danne biofilm i et mikrotiterplate assay. En tidligere analyse av promoter–regionen til BC1060 ortologen i B. thuringiensis 407 viste dessuten at den innholder en perfekt match til klasse I c–di–GMP responsive riboswitchen som tidligere ble identifisert i BC1060 oppstrøms–regionen i B.cereus ATCC 14579. Denne riboswitchen er vist å respondere på økt nivå av c–di–GMP ved å slå på transkripsjon av nedstrømsliggende gen BC1060 i B. cereus ATCC 14579.
I denne oppgaven ble genekspresjon på RNA–nivå analysert ved qPCR, og det ble vist at ekspresjon av BC1060 var 3 ganger høyere i B. thuringiensis 407 villtype sammenliknet med en cdg135 delesjonsmutant, i overenstemmelse med at BC1060 kan reguleres av c–di–GMP produsert av Cdg135, via BC1060–genets oppstrøms riboswitch. Ved bioinformatikk–analyse ble BC1060 allikevel vist ikke å være essensiell for biofilmdannelse i B. cereus–gruppen, da stammen B. cereus ATCC 10987, som er en effektiv biofilm–danner, ikke har genet. Med mål om å rense N1–N2 subdomener av BC1060, ble denne delen av proteinet klonet i E. coli. Klonen viste imidlertid ingen produksjon av N1–N2–subdomenene ved SDS–polyakrylamidgelelektroforese, og betingelser for ekspresjon må optimaliseres før en eventuell ligand for subdomenene kan identifiseres. | nor |