Atorvastatin hemmer aktiviteten av cysteinproteaser og stimulerer sekresjonen av MMP-9

Abstract

I tillegg til de etablerte kolesterolsenkende effektene av statiner, indikerer nye studier at statiner utviser tilleggseffekter (pleiotrope effekter) som kan forklare deres terapeutiske suksess. Nylig ble det vist at mRNA for cysteinproteasene legumain og cathepsin B ble nedregulert i monocytter/makrofager hos pasienter behandlet med atorvastatin. Makrofager spiller en sentral rolle i utviklingen av aterosklerotiske plakk, og det er nylig gjort funn som viser at legumain og cathepsin B er oppregulert i ustabile plakk i forhold til stabile plakk. Det proteolytiske maskineriet hos makrofager er ansett å være en kritisk faktor i progresjonen av aterosklerose. I masteroppgaven ble fokuset rettet mot effektene av atorvastatin på makrofager og reguleringen av cysteinproteasene legumain og cathepsin B, samt matriks metalloproteasene MMP-2 og -9.

I denne studien ble RAW 264,7 makrofager fra mus brukt som cellemodell. Makrofagene ble stimulert med økende konsentrasjoner av atorvastatin med eller uten mevalonolakton til stede. Aktivitet av legumain og cathepsin B ble målt ved bruk av enzymspesifikke substrater og proteinuttrykk ble bestemt ved hjelp av immunoblotting. Sekresjon av MMP-2 og -9 ble analysert ved hjelp av zymografi. Celleviabilietsmålinger ble utført med MTS-analyser. Resultatene viste at økende konsentrasjoner av atorvastatin forårsaket en doseavhengig reduksjon av legumain- og cathepsin B-aktivitet hos makrofager. Tilleggsbehandling med mevalonolakton motvirket deler av atorvastatineffektene. Overraskende nok utviste atorvastatin stimulerende effekter på sekresjon av MMP-9, mens det ikke ble observert noen forandringer i sekresjon av MMP-2. Behandlingene av makrofagene med atorvastatin alene viste en reduserende effekt på celleviabiliteten, noe som ble delvis motvirket ved tilsetning av mevalonolakton.

Konklusjon: Atorvastatin reduserer aktivitet og proteinuttrykk av legumain og cathepsin B i RAW-makrofager gjennom hemming av mevalonsyresyntesen. Atorvastatin har en stimulerende effekt på sekresjon av MMP-9 fra RAW-makrofager og en reduserende effekt på celleviabiliteten, noe som blir delvis motvirket ved tilsetning av mevalonolakton.

Besides the established effects of statins on lowering plasma cholesterol, new studies indicate that the statins exhibit additional effects (pleiotropic effects) that could explain their therapeutic success. Recently, it was shown that mRNA for the cysteine proteases legumain and cathepsin B was down-regulated in monocytes/macrophages from patients treated with atorvastatin. In the atherosclerotic plaque, transformed macrophages play a pivotal role in pathophysiology and legumain has previously been found to be upregulated in human unstable versus stable atherosclerotic plaques. The proteolytic machinery of macrophages is considered to be a critical factor in the progression of atherosclerosis. Here we present data on the effects of atorvastatin on the regulation in macrophages of the cysteine proteases legumain and cathepsin B, as well as the matrix metalloproteases MMP-2 and -9.

In this study murine RAW 264.7 macrophages were used as a cell model and stimulated with atorvastatin lactone and/or mevalonolactone. Legumain and cathepsin B were analyzed by activity measurements using specific fluorogenic substrates and immunoblotting, whereas MMP-2 and -9 were analyzed by zymography. Cell viability was measured by MTS-analyses.

Increasing concentrations of atorvastatin exhibited a dose-dependent reduction of both legumain and cathepsin B activities in the macrophages and addition of mevalonolactone seemed to partly prevent these effects. Surprisingly, macrophages secreted increased levels of MMP-9 when exposed to increasing concentrations of atorvastatin. No differences were observed for MMP-2. No consistent effect of mevalonolactone was observed. Atorvastatin caused reduced viability of RAW cells when exposed to high concentrations. Mevalonolactone was able to prevent some of these effects on cells treated with atorvastatin.

To conclude, atorvastatin reduces activity and protein expression of legumain and cathepsin B in RAW macrophages by inhibiting the mevalonate synthesis. Also, atorvastatin has a stimulating effect on the secretion of MMP-9 from RAW macrophages. Mevalonolactone has a protecting effect on cell viability when treated with atorvastatin.