Sorteringsstudier av serglysin-varianter i MDCK II-celler

Abstract

Epitelcellelinjen ”Madin-Darby canine kidney (MDCK)” er en velstudert polarisert cellelinje som danner tette cellelag med separate apikale og basolaterale membrandoméner. Proteoglykaner sorteres til både den apikale og den basolaterale side i MDCK-celler, men mekanismene bak sorteringen og transporten er i stor grad ukjente. Tidligere arbeid i forskningsgruppa har vist at mesteparten av det sekretoriske proteoglykanet serglysin skilles ut apikalt fra MDCK II-celler og at glykosaminoglykan (GAG)-kjedene hovedsakelig er kondroitinsulfat (CS)-kjeder (Tveit et al. 2005). Det ble videre vist at CS-kjedene som ble isolert fra serglysin i det basolaterale mediet var kortere, men betydelig mer sulfaterte enn de som var transportert apikalt. Det var også forskjeller i sulfateringen av linker-tetrasakkaridet til serglysin og i GAG-kjede sammensetningen (Vuong et al. 2006). Disse resultatene har åpnet for at sortering i apikal og basolateral retning kan skje tidlig i den sekretoriske vei, før GAG-kjedene er polymerisert. Dette gir grunn til å undersøke hvordan endringer i selve proteindelen av serglysin påvirker syntese og sortering av proteoglykanet. Det ble derfor konstruert plasmider med DNA som koder for ulike serglysin-varianter. Disse ble stabilt transfektert inn i MDCK II-celler og sekresjonsmønsteret ble studert. I dette arbeidet ble det vist at apikal sortering av serglysin betinger mer enn én CS-kjede. Endringer i serglysin sin proteinkonformasjon og forsterket intracellulær retensjon påvirket syntesen av GAG-kjeder, men ikke polariteten av sekresjonen. Felles for de ulike variantene av serglysin uttrykt i MDCK-celler i denne oppgaven var at GAG-kjedene var mer sulfaterte basolateralt, uavhengig av om kjedesammensetningen var endret til bare CS-kjeder, til mer heparansulfat (HS)-kjeder eller om sorteringen var endret fra en polarisert apikal sortering til en upolarisert fordeling. Den mer intense sulfateringen av GAG-kjeder i den basolaterale sekretoriske vei i MDCK-celler ser dermed ut til å være en robust egenskap. Serglysin kan akkumuleres tidlig i den sekretoriske vei, enten etter redusert transport av proteiner fra Golgi-apparatet til plasmamembranen med tilsetning av Brefeldin A (BFA) (upubliserte data fra forskningsgruppen) eller ved å uttrykke en serglysin-variant med en KDEL-sekvens helt C-terminalt, som utført i denne oppgaven. Når serglysin ble oppkonsentrert tidlig i den sekretoriske vei, ble noen serglysin-molekyler transportert direkte til det apikale mediet uten å passere gjennom Golgi-apparatet. Disse serglysin-molekylene ser ut til å inneholde noe av linker-regionen, men var uten polymeriserte GAG-kjeder eller modifikasjoner av linker-regionen.