Kloning, ekspresjon og karakterisering av DNA polymerase I fra Thermus thermophilus

Abstract

DNA polymeraser er av fundamental betydning for levende organismer, ettersom de spiller en avgjørende rolle i replikasjon og reparasjon av DNA. I de siste årene er de blitt viktige genteknologiske verktøy, og varmestabile polymeraser blir benyttet i in vitro-teknikker som polymerase kjedereaksjon (PCR) og DNA sekvensering.

I denne hovedoppgaven ble det innført en mutasjon i genet for DNA polymerase I fra bakterien Thermus thermophilus og testet det muterte enzymet i sekvenseringsreaksjoner og PCR med både DNA og RNA som templat. Mutasjonen ble innført i kodonet for aminosyre 662, hvor arginin ble byttet ut med asparginsyre, i genet for Tth DNA polymerase I hvor mutasjonen F669Y alt var innført og blir i denne oppgaven omtalt som den native polymerasen. Andre har innført tilstedeværende mutasjoner i Taq polymerase, (Li, Y. et. al, 1999), og vist at enzymet inkorporerer merkede dideoksynukleotider med jevnere hastighet for alle de fire dideoksynukleotidene i en voksende DNA-kjede, noe som er en viktig egenskap i DNA-sekvensering.

Thermus thermophilus er en varmestabil eubakterie som har et temperaturoptimum ved 80C, noe som er en fordel i sekvensering ved kjedeterminering hvor DNA-fragmentene blir denaturert ved 95C i hver syklus. Hvis man da benytter varmestabile DNA polymeraser trenger man ikke å tilsette nytt enzym for hver syklus. Denne mutasjonen skulle føre til mindre diskriminering mot fluorescensmerkede dideoksynukleotider og dette ble undersøkt ved Cy5-dCTP merking med RNA som templat.

Både villtype, nativ og muterte Tth polymeraser ble uttrykt i E.coli-celler og det ble laget lysat som inneholdt de aktive enzymene. Optimal ekspresjonstid, lineært område og antall enheter i lysatene ble bestemt ved hjelp av en fluorescensbasert aktivitetsanalyse. Deretter ble DNA felt ut fra lysatene ved streptomycinsulfat, og videre undersøkelser av enzymene ble gjort på de streptomycinrensede lysatene. De streptomycinrensede lysatene for den muterte og den native DNA polymerasen ble benyttet i sekvensering av både DNA og RNA som templat på ALF Express.

Det ble også gjort en statistisk sammenligning mellom den muterte og den native DNA polymerasen og leselengden av sekvensene. Det viste seg at den muterte polymerasen leser omtrent 100 baser lengre enn den native polymerasen og ved hjelp av t-test er det vist at det kun er en 0,6% sannsynlighet for å observere de testresultatene som er gjort i forsøkene i denne oppgaven dersom de to polymerasene skulle ha identiske egenskaper. Med en p-verdi lavere enn både 5 prosent og 1 prosent, kan hypotesen om ingen differanse mellom den muterte og den native polymerasen forkastes både på et 95 % og 99 % sikkerhetsnivå. Den alternative hypotesen om at den muterte leser lengre sekvenser enn den native polymerasen støttes ved et resultat som er statistisk signifikant på 0,6 prosents nivå. Begge polymerasene leser altså sekvensene korrekt, men den muterte polymerasen viste seg å kunne lese lengre sekvenser med sikkerhet enn den native polymerasen.