Isolering, kloning og ekspresjon av groESL2-operonet fra den termofile bakterien Chloroflexus aurantiacus

Abstract

Chaperoninene GroEL og GroES er en gruppe molekylære chaperoner som hittil er funnet i alle bakterier. Genene som koder for chaperoniner er vanligvis organisert i operoner på genomet. Den moderat termofile grønne glidende bakterien Chloroflexus aurantiacus har to groESL-operoner, groESL1 og groESL2, der groESL1 trolig uttrykkes ved temperaturer nær bakteriens maksimumstemperatur. Målet i denne oppgaven var å isolere groES2 og groEL2-genene fra C. aurantiacus og få dem uttrykt fra ekspresjonsvektorer, samt å undersøke om andre former for stress enn varme induserer chaperoninekspresjon i C. aurantiacus. Genene groES2 og groEL2 ble isolert ved hjelp av PCR og satt inn hver for seg i pET101/D-TOPO vektorer og forsøkt uttrykt med pET 101 Directional TOPO Expression Kit, men bare ekspresjon av groEL2 lyktes. Det ble funnet to kodoner i 5' enden av groES2 som er svært sjeldne i E. coli, og da det kunne være en årsak til lav eller ingen ekspresjon, ble groES2 amplifisert med PCR der foroverprimeren var en mutasjonsprimer som muterte de sjeldne kodonene til mer vanlige kodoner. Det muterte groES2-genet ble heller ikke uttrykt. Som en positiv kontroll ble groES-genet fra E. coli forsøkt uttrykt på samme måte som groES2, og det lyktes. Genet groES2 ble forsøkt uttrykt på en rekke forskjellige måter som muligens kunne øke ekspresjonsnivået fra pET101/D-TOPO vektoren: ulike konsentrasjoner av induksjonsfaktoren og antibiotika, lavere temperaturer, 1 % glukose i vekstmediet og mer næringsrikt vekstmedium. Ingen av metodene ga ekspresjon. Genet groES2 lot seg tilslutt uttrykke fra pET 102/D-TOPO vektoren med Champion™ pET 102 Directional TOPO® Expression Kit, som et fusjonsprotein til tioredoksin. Cellefrie ekstraker av celler fra C. aurantiacus dyrket ved ulike former for stress ble analysert med SDS-PAGE. På gelene ble det sett etter økning i ekspresjon av proteiner rundt 60 kDa, som er molekylvekten til GroEL-proteinet. Stressfaktorene C. aurantiacus ble utsatt for var: sterkt lys, lav og høy pH, etanol, natriumklorid og hydrogenperoksid. Bare eksponering for hydrogenperoksid viste en sterk økning i ekspresjonen av proteiner rundt 60 kDa. Det ble bestemt at et av disse proteinbåndene, som var rundt 60-70 kDa, skulle N-terminal aminosyresekvenseres. Først ble proteinet forsøkt renset med RP-HPLC, men da dette var vanskelig ble proteinet elektroblottet fra gelen til en PVDF-membran. Det ønskede båndet ble kuttet ut fra membranen og påfølgende N-terminal aminosyresekvensering viste at sekvensen verken tilhørte chaperoninene GroEL1, GroEL2 eller chaperonet DnaK. Den sekvenserte N-terminale aminosyresekvensen var imidlertidig for kort til å kunne bestemme hvilket protein den tilhørte.