Motilitetsrepressoren MogR i Bacillus cereus-gruppen – Ekspresjonsanalyser og kloning av mogR-FLAG for global kartlegging av DNA-bindingsseter

Abstract

Medlemmer av Bacillus cereus-gruppen (B. cereus sensu lato) er Gram-positive, stavformede, aerobe eller fakultativt anaerobe, sporedannende bakterier med en vid utbredelse i det naturlige miljøet. Alle etablerte arter i B. cereus-gruppen har stammer som i kromosomet bærer mogR. Motilitetsrepressoren MogR er et transkripsjonsregulator-protein som hindrer transkripsjon av motilitetsgener, inkludert gener som er essensielle for dannelsen av flageller, og vil således hemme motilitet av bakterien. I B. cereus-gruppen har mogR en konservert lokasjon i motilitetslokus. Dette gjelder selv medlemmer som ikke er motile, slik som for eksempel Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides og Bacillus anthracis, som gjennom evolusjonen har mistet mange eller alle øvrige gener i motilitetslokuset. De eneste organismene som er påvist å ha gener som koder for MogR-homologer er bakterier i B. cereus-gruppen, samt Listeria-arter. Målet med arbeidet i denne oppgaven var å utvikle kloner, som ved uttrykk av en FLAG-tagget versjon av MogR kan bidra til å kartlegge hvilke gener som er under direkte transkripsjonell kontroll av MogR, samt å bidra til å forklare årsaken til hvorfor mogR fortsatt finnes i den samme kromosomale plasseringen i ikke-motile medlemmer av B. cereus-gruppen. I arbeidet beskrevet i denne oppgaven ble forskjeller i ekspresjon av mogR i eksponentiell og tidlig posteksponentiell vekstfase undersøkt i B. thuringiensis 407 Cry- og B. pseudomycoides DSM 12442. Resultater fra kvantitativ PCR viste at mogR uttrykkes i den ikke-motile arten B. pseudomycoides DSM 12442, noe som også er blitt vist i den ikke-motile arten B. anthracis i andre studier. Dette kan antyde at MogR har andre funksjoner i B. cereus-gruppen, utover å kun virke som en regulator av motilitet. Ved overuttrykk av mogR i en ΔflaAB delesjonsmutant som ikke syntetiserer flagellin, ble det vist at MogR i B. thuringiensis 407 nedregulerer ekspresjon av enterotoksinene Hbl, Nhe og CytK, og at toksinene fraktes ut av cellen uavhengig av om cellen danner flageller eller ikke. I arbeidet ble også en FLAG-tagget versjon av mogR klonet inn i en ekspresjonsvektor og overført til modellstammen B. thuringiensis 407 Cry-, hvor uttrykk av MogR-FLAG-fusjonsprotein ble bekreftet ved Western blott. Denne klonen kan benyttes i videre studier for å identifisere gener som er under direkte transkripsjonskontroll av MogR ved bruk av ChIP-Seq.

Members of the Bacillus cereus group (B. cereus sensu lato) are Gram positive, rod shaped, aerobic or facultative anaerobic, spore-forming bacteria that are widely distributed across the natural environment. All established species of the B. cereus group have strains carrying mogR in their chromosome. The motility repressor MogR is a transcriptional regulator protein, which inhibit the transcription of motility genes, including genes essential for flagellar assembly, hence inhibiting bacterial motility. In the B. cereus group mogR has a conserved location in the motility locus. Even the non-motile members of the B. cereus group, including Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides and Bacillus anthracis, carry the mogR gene despite the loss of many or all other genes in the motility locus throughout evolution. The only organisms found to carry genes encoding MogR-homologues are bacteria of the B. cereus group and species of Listeria. The purpose of the work provided in this thesis was to contribute toward mapping which genes are subject to direct transcriptional control of MogR, and contribute to explaining why mogR is retained in the same chromosomal location in non-motile members of the B. cereus group. In the work provided in this thesis differences in expression of mogR in the exponential and the early post exponential growth phase were examined in B. thuringiensis 407 and B. pseudomycoides DSM 12442. The results following quantitive PCR showed expression of the mogR gene in the non-motile species B. pseudomycoides, which also has been shown in the non-motile species B. anthracis in previous studies. This may imply that MogR has other functions in the B. cereus group beyond acting as a motility regulator. By overexpression of mogR in a ΔflaAB deletion mutant which does not synthesize flagellin, it was shown that MogR in B. thuringiensis 407 downregulated the expression of the enterotoxins Hbl, Nhe and CytK, and that toxin was transported out of the cell independent of flagellar formation. In addition, a FLAG tagged version of mogR was cloned into an expression vector and transferred to the model strain B. thuringiensis 407 Cry-, and the expression of MogR-FLAG fusion protein was confirmed in a Western blot. This clone may be utilized in futher studies for identifying genes that are under direct transcriptional control of MogR in a ChIP-Seq study.