Abstract
Det ble i dette arbeidet optimalisert ekstraksjons¬betingelser for 18 rusmidler med ekstraksjonsteknikken Parallel artificial liquid membrane extraction (PALME). Prøvetakings-metoden Volumetric Absorptive Microsampling (VAMS) ble testet ut i kombinasjon med PALME for første gang, og metoden ble validert. Repertoaret dekker de vanligste stoffgruppene som analyseres for å vurdere påvirket kjøring, slik som amfetaminer, kokain, opioider, benzo¬diazepiner, og benzodiazepinlignende stoffer. Stoffene utgjorde et bredt spekter av legemidler og rusmidler med ulike kjemiske egenskaper. Polariteten til stoffene varierte fra log P = 0,9 for morfin til 5,9 for THC. Virkestoffet i cannabis, THC, og opioidet buprenorfin viste seg vanskelig å inkludere i metoden. Morfin og buprenorfin var zwitterioner og representerte en gruppe analytter som var forventet å gi utfordringer i denne metoden. PALME er en væske-fase mikroekstraksjonsmetode, som er utviklet fra hollow-fiber liquid phase microextraction (HF-LPME). Ekstraksjonsteknikken er utviklet på Seksjon for farmasøytisk kjemi, Farmasøytisk institutt, Universitetet i Oslo. Teknikken utføres i et 96-brønns format, og utgjør et trefasesystem hvor analyttene ekstraheres fra vandige prøver i en donorbrønn, over en organisk væskemembran, til en vandig akseptorløsning. Separasjonen av analytter og komponenter i prøveløsningen baseres på en pH-gradient, som dannes ved å justere pH i prøveløsningen og akseptorløsningen. VAMS som prøvetakingsmetode kombinert med PALME, ble evaluert ved å sammenligne blodprøver applisert på VAMS med blod som ble pipettert direkte i PALME-platen. VAMS som prøvetakingsmetode gav lovende resultater med stort sett tilfredsstillende linearitet (R2-verdier fra 0,983–0,999), men med noe lavere presisjon. VAMS kombinert med PALME gav en effektiv prøveopparbeidelsesmetode, ved at «prøvesvampene» ble puttet direkte i en 96-brønnsplate og analyttene ble ekstrahert, uten forutgående eluering. I den optimaliserte PALME-metoden bestod donorløsningen av 185 μl 200 mM karbonatbuffer, 20 μl internstandard og 20 μl fullblod fra VAMS. Væskemembranen bestod av 4 μl undecanon:dihexyleter 1:1 med 1 % TOA (w/w/w) og akseptorløsningen bestod av 100 μl DMSO:200 mM HCOOH 75:25 (v/v). Validering av metoden inneholdt følgende parametere: Linearitet, innen- og mellom-serie-variasjon, minste detekterbare og kvantifiserbare konsentrasjon (MDK og MKK), ekstraksjonsutbytte, matrikseffekter, selektivitet og overdrag. For 17 av 20 stoffer var linearitet i overensstemmelse med EMA Guideline krav (R2=0.99). For innen-serie-variasjon var %-RSD < 15 % for 16 av 20 stoffer, mens tilsvarende tall for mellom-serie-variasjon var åtte av 20 stoffer. Nøyaktigheten var innenfor ±15 % for 18 av 20 stoffer. Minste kvantifiserbare konsentrasjon var i området 0,3–7,5 ng/ml for samtlige analytter. Ekstraksjonsutbyttene for de fleste analyttene var mellom 80 og 120 %. Matrikseffekter for analyttene var innenfor grensen på ± 20 % (80–120 %) for 17 av 20 stoffer. Det ble ikke observert overdrag i systemet etter injeksjon av analytt i høye konsentrasjoner. Den validerte metoden ble brukt til å ekstrahere fullblodsprøver samlet til en veikantundersøkelse som ble utført for å følge med på utviklingen av rusmiddelbruk i trafikken på Østlandet. Blodprøvene oppsamlet med VAMS som prøvetakingsmetode, ble bekreftet negative for de 18 legemidlene og rusmidlene prøveopparbeidelse- og analyse-metoden inkluderte. VAMS som prøvetakingsmetode viste seg i praksis utfordrende i veikanten ved at det var vanskelig å få ut nok blod til «prøvesvampen», og prøvetakingssteget må videre optimaliseres. I tillegg kan det være interessant å se på andre aktuelle bruksområder for VAMS innen rettsmedisinen. PALME som ekstraksjonsteknikk gir flere fordeler som lavt løsemiddelforbruk, gode muligheter for oppkonsentrering, med et utstyr som er lett å håndtere, og som er kommersielt tilgjengelig. Teknikken er vist å gi rene ekstrakter, og kan potensielt automatiseres i større laboratorier. Metoden som ble utviklet viste lovende resultater, og mye av grunnlaget for en effektiv prøveopparbeidelsesmetode med VAMS og PALME er lagt. Noe videre arbeid kreves gjennomført før metoden potensielt kan brukes i et rutinelaboratorium. Dersom dette lar seg gjøre kan man potensielt spare tid, penger og arbeidskraft.