Hide metadata

dc.contributor.authorGjonbalaj, Nora
dc.date.accessioned2018-08-21T22:02:22Z
dc.date.available2020-05-15T22:46:20Z
dc.date.issued2018
dc.identifier.citationGjonbalaj, Nora. LPS og TNF-alfa regulerer legumain og cathepsin B under osteoblastdifferensiering av humane mesenkymale stamceller. Master thesis, University of Oslo, 2018
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/10852/63445
dc.description.abstractInflammasjon er en viktig faktor i beintapssykdommer og indikerer at immunsystemet påvirker beinhomeostasen negativt. Legumain er en lysosomal cysteinprotease som spalter proteiner ved aminosyren asparagin og er assosiert med ulike sykdommer hvor inflammasjon er involvert som aterosklerose, osteoporose og kreft. Inflammasjon spiller en nøkkelrolle i tilstander som påvirker beinresorpsjon og – dannelse, som ved tilheling etter beinbrudd. Tumornekrosefaktor-alfa (TNF-α) er et proinflammatorisk cytokin som er økt ved flere inflammatoriske tilstander. Lipopolysakkarid (LPS) fra Gram-negative bakteriers cellevegg stimulerer osteoblaster til å frigjøre TNF-α o.a. cytokiner, som videre fører til aktivering av osteoklaster. Det har nylig blitt beskrevet at legumain hemmer osteoblastdifferensiering og beinmineralisering in vivo ved degradering av fibronektin. Uttrykket av legumain øker de første dagene under osteoblastdifferensieringen, for deretter å bli borte etter to-tre uker. I denne studien undersøkes uttrykk, aktivitet og sekresjon av cysteinproteasene legumain og cathepsin B i humane mesenkymale stamceller (hMSC) etter eksponering for LPS eller TNF- α under differensiering til osteoblaster. Effekt av samtidig eller påfølgende behandling med deksametason ved TNF-α-mediert inflammasjon under osteoblastdifferensiering ble også studert, og omtalt som henholdsvis ”kronisk” og ”akutt” inflammasjon med behandling. Som cellemodell ble hMSC-TERT4-celler (hMSC stabilt transfektert med telomerase revers transkriptase) brukt og behandlet med LPS (10 ng/ml og 1 μg/ml) eller TNF-α (10 ng/ml og 50 ng/ml) i 3, 7 eller 14 dager under differensiering til osteoblaster. Aktivitet av legumain og cathepsin B ble analysert i cellelysater ved enzymaktivitetsmåling og uttrykk av legumain ble analysert ved immunoblotting, mens legumainsekresjon i kondisjonert medium ble analysert ved ”Enzyme-Linked immunosorbent assay” (ELISA). I tillegg ble celleviabilitet målt med MTS-assay og totalprotein målt i cellelysater. Som markører for osteoblastdifferensiering ble aktivitet av alkalisk fosfatase (ALP) og matriksmineralisering målt. Det ble også benyttet Oil Red O for farging av fettdannelse under behandlingen. I denne studien ble det vist at LPS (10 ng/ml) oppregulerte legumainsekresjonen signifikant etter 7 dager, men påvirket ikke aktivitet av hverken legumain eller cathepsin B i hMSCTERT4- celler. TNF-α førte til økt av aktivitet av både legumain og cathepsin B og uttrykk av legumain (36 kDa) var høyest i celler behandlet med 50 ng/ml TNF-α i 3 og 7 dager. Både LPS og TNF-α stimulerte matriksmineralisering etter 14 dager og behandling med 10 ng/ml TNF-α økte matriksmineraliseringen signifikant. Det ble derimot vist signifikant nedregulering av legumainsekresjonen etter både ”kronisk” og ”akutt” TNF-α-mediert inflammasjon med behandling og uavhengig av deksametasonkonsentrasjonen.nob
dc.description.abstractInflammation is an important factor in bone loss diseases, indicating that the immune system negatively affects the bone homeostasis. Legumain is a lysosomal cysteine protease that cleaves proteins at the amino acid asparagine and is associated with various diseases in which inflammation is involved such as atherosclerosis, osteoporosis and cancer. Inflammation plays a key role role in conditions affecting bone resorption and formation, such as healing after bone fracture. Tumornecrosisfactor-α (TNF-α) is a pro-inflammatory cytokine that is increased in several inflammatory conditions. Lipopolysaccharide (LPS) from Gram-negative bacteria cell wall stimulates osteoblasts to release TNF-α and other cytokines that stimulate release of RANKL from osteoblasts and further activate osteoclasts. It has recently been shown that legumain inhibits osteoblast differentiation and bone mineralization in vivo by degradation of fibronectin. Legumain expression increases during the first few days of osteoblast differentiation then disappears after two to three weeks. In this study we analyse expression, activity, and secretion of the cysteine proteases legumain and cathepsin B in human mesenchymal stem cells (hMSC) after exposure to LPS and TNF-α during differentiation into osteoblasts. The effect of simultaneous or subsequent treatment with dexamethasone on TNF-α mediated inflammation during osteoblast differentiation was also studied and referred as “chronic” and “acute” inflammation with treatment. Human MSC-TERT4 cells (hMSC stably transfected with telomerase reverse transcriptase) were used as a cell model and treated with LPS (10 and 1000 ng/ml) or TNF-α (10 and 50 ng/ml) in 3, 7 and 14 days during differentiation to osteoblasts. Activities of legumain and cathepsin B were analysed in cell lysates by enzyme activity measurement and legumain expression was analysed with immunoblotting while legumain secretion was analysed in conditioned media by enzyme-linked-immunosorbent assay (ELISA). In addition, cell viability was measured with MTS-assay and total protein was measured in cell lysates. As markers of osteoblast differentiation, alkaline phosphatase (ALP)-activity and matrix mineralization was measured. Oil Red O was also used for staining of fat formation during treatment. In this study it was shown that LPS (10 ng/ml) upregulated legumain secretion after 7 days, but did not affect the activity of neither legumain nor cathepsin B in hMSC-TERT4 cells. TNF-α led to increased activity of both legumain and cathepsin B and expression of legumain (36 kDa) was highest in cells treated with 50 ng/ml TNF-α for 3 and 7 days. Both LPS and TNF-α stimulated matrix mineralization after 14 days and treatment with 10 ng/ml TNF-α increased the matrix mineralization significantly. However, it was shown a significant downregulation of legumain secretion after both “chronic” and “acute” TNF-α-mediated inflammation and independent of dexamethasone concentration.eng
dc.language.isonob
dc.subject
dc.titleLPS og TNF-alfa regulerer legumain og cathepsin B under osteoblastdifferensiering av humane mesenkymale stamcellernob
dc.title.alternativeLPS and TNF-alfa regulate legumain and cathepsin B under osteoblst differentiation of human mesenchymal stem cellseng
dc.typeMaster thesis
dc.date.updated2018-08-21T22:02:22Z
dc.creator.authorGjonbalaj, Nora
dc.identifier.urnURN:NBN:no-65846
dc.type.documentMasteroppgave
dc.identifier.fulltextFulltext https://www.duo.uio.no/bitstream/handle/10852/63445/15/Masteroppgave-Nora-Gjonbalaj.pdf


Files in this item

Appears in the following Collection

Hide metadata