Hide metadata

dc.contributor.authorKasem, Roya
dc.date.accessioned2015-08-11T22:00:15Z
dc.date.available2015-08-11T22:00:15Z
dc.date.issued2015
dc.identifier.citationKasem, Roya. N-bundet glykosylering: Betydning for sekresjon og autoaktivering av legumain i humane celler. Master thesis, University of Oslo, 2015
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/10852/44773
dc.description.abstractLegumain er en asparaginyl endopeptidase som generelt er uttrykt i de fleste normale humane vev. Studier har imidlertid vist at proteinuttrykket av legumain er oppregulert i flere faste svulster. Høyt uttrykk av legumain har blitt assosiert med cellemigrasjon og invasjon, og påfølgende dårlig prognose. Årsaken til kreftcellers spredning er fortsatt ikke kjent, men proteaser har blitt antatt å delta i denne prosessen. Proteaser kan derfor være lovende å utnytte i kreftterapi, men manglende kunnskap har ført til svikt i kliniske studier. Foreløpig, er det mange ukjente aspekter ved den subcellulære lokaliseringen, den cellulære transporten og aktiveringen av legumain. I to nylig publiserte studier i forskningsgruppen vår er det funnet at glykosylering av legumain er viktig for legumainprosessering, og at glukosaminoglykaner (GAGs) akselererer autoaktiveringen av normalprodusert (glykosylert) og sekrert pro-legumain. Disse observasjonene ble studert videre i denne oppgaven. I denne studien ble betydningen av N-koblet glykosylering av legumain undersøkt med hensyn på aktivitet, sekresjon og proteinuttrykk av legumain. To ulike celletyper ble utnyttet i studien, en monoklonal legumaintransfektert HEK293-cellelinje (M38L) og en tykk-/endetarmskreftcellelinje (HCT116). N-koblet glykosylering av legumain ble hemmet ved behandling av cellene med tunikamycin, som er et effektivt verktøy i biokjemiske studier. Autoaktivering av henholdsvis glykosylert og uglykosylert prolegumain ble undersøkt ved surgjøring av kondisjonerte medier og cellelysater fra nøytral pH til pH 4.0. I tillegg ble effekten av GAGs (kondroitin-4-sulfat (C4S) og heparansulfat (HS)) undersøkt på autoaktivering av glykosylert og uglykosylert sekrert prolegumain. Resultatene viste at prosessering av legumain til moden, uglykosylert, aktiv form (28 kDa) var totalt fraværende etter tunikamycinbehandling av HCT116-celler, mens formen ble observert i tunikamycinbehandlede M38L-celler. Videre ble det i lysater observert reduksjon i totalproteinkonsentrasjon og legumainaktivitet etter behandling med tunikamycin. Lav konsentrasjon (0,025 µg/ml) av tunikamycin økte signifikant sekresjonen av prolegumain, mens høye konsentrasjoner (1 og 5 µg/ml) hadde tendens til å redusere sekresjonen. Selv om ulike GAGs tidligere er vist å akselerere autoaktivering av glykosylert prolegumain, så viste denne studien at C4S og HS ikke akselererte autoaktivering av uglykosylert prolegumain på samme måte. Det antas derfor at oligosakkarid-gruppene på prolegumain spiller en viktig rolle i interaksjonen med GAGs. Av de to GAGs som ble benyttet i denne studien (C4S og HS) så var det kun C4S som akselererte autoaktivering av prolegumain. GAGs effekt på autoaktivering av prolegumain ser ut å være konsentrasjonsavhengig. Generelt viste resultatene at normal cellulær glykosylering er viktig for aktivitet, stabilitet og sekresjon av legumain.  nor
dc.description.abstractLegumain is an asparaginyl endopeptidase that is normally expressed in most normal human tissues. Studies have shown that protein-expression of legumain is upregulated in several solid tumors. Overexpression of legumain has been associated with cell migration and invasiveness and gives a poor prognosis. The complete reason for why cancer cells spread and metastasize is still not known, but proteases have been proposed to participate in this process. Therefore, proteases may be promising to utilize in cancer therapy. However, the lack of knowledge has led to unsucessful clinical trials. Currently, there are several unknown aspects of the mechanisms behind the subcellular localization, cellular transport and activation of legumain. In two recent studies in our research group it was shown that glycosylation of legumain is important for legumain processing, and that glycosaminoglycans (GAGs) are accelerating autoactivation of normally produced (glycosylated) and secreted prolegumain. These observations were further studied in this thesis. In this study, we investigated the significance of N-linked glycosylation on activity, secretion and protein expression of legumain. We used two cell lines, the legumain-transfected HEK293 cell line (M38L) and the colorectal cancer cell line HCT116. N-linked glycosylation was inhibited by the treatment of cells with tunicamycin, which is a useful tool in biochemical studies. Autoactivation of respectively glycosylated and unglycosylated prolegumain was investigated by acidification of the conditioned media and cell lysates from neutral conditions to pH 4.0. The effect of glycosaminoglycans (Chondroitin 4-sulphate (C4S) and heparan sulphate (HS)) on the autoactivation of glycosylated and unglycosylated secreted prolegumain was also investigated. The results have shown that the processing of legumain to mature active form of legumain was totally absent after tunikamycin treatment in HCT116-cells, but was observed in tunikamycin treated M38L-cells. Total protein concentration and activity of legumain in lysates were reduced after treatment with tunikamycin. The data presented show that low concentrations (0,025 µg/ml) of tunikamycin increased the secretion of prolegumain, in contrast to the high concentrations (1 and 5 µg/ml), which had a tendency to decrease the secretion. Although various GAGs were previously shown to accelerate the autoactivation of glycosylated prolegumain, this study showed that C4S and HS did not accelerate autoactivation of unglycosylated prolegumain in the same fashion. It is therefore believed that the oligosaccharide groups on prolegumain play an important role in the interaction with GAGs. Of the two GAGs that were used in this study (C4S and HS), it was only C4S that accelerated autoactivation of prolegumain. It seems that the effect of GAGs on autoactivation of prolegumain is concentration dependent. In general, the results suggest that glycosylation is important for activity, stability and secretion of legumain.eng
dc.language.isonor
dc.subjectLegumain
dc.subjectkreft
dc.subjectprodrug
dc.subjectautoaktivering
dc.subjectsekresjon
dc.subjectog
dc.subjectproteinuttrykk
dc.titleN-bundet glykosylering: Betydning for sekresjon og autoaktivering av legumain i humane cellernor
dc.titleN-linked glycosylation: significance for secretion and autoactivation of legumain in human cellseng
dc.typeMaster thesis
dc.date.updated2015-08-11T22:00:15Z
dc.creator.authorKasem, Roya
dc.identifier.urnURN:NBN:no-48972
dc.type.documentMasteroppgave
dc.identifier.fulltextFulltext https://www.duo.uio.no/bitstream/handle/10852/44773/1/Masterlevering-5-5-2015.pdf


Files in this item

Appears in the following Collection

Hide metadata