Betydningen av legumain og cystatin E/M for aktivering av caspase-3

Abstract

Apoptose er programmert celledød for å fjerne uønskede celler og er en felles egenskap for alle flercellede organismer. Caspase-3 er involvert i intracellulære signalkaskader ved apoptose. En ubalanse i regulering av apoptose kan føre til kreftutvikling. Apoptose spiller en viktig rolle i flere andre sykdommer som immunologisk, iskemiske, og nevrodegenerative sykdommer. For å undersøke betydningen av proteasen legumain og proteaseinhibitoren cystatin E/M for caspase-3 aktivitet, ble det brukt HEK293 (normale kontroll celler), M38L (overutrykker legumain) og M4C (overutrykker cystatin E/M) celler. Cellene ble stimulert med dødsstimulerende stoffer som staurosporin og Leu-Leu-OMe. Staurosporin er kjent for å være en kinasehemmer. Leu-Leu-OMe øker lysosomal membranpermeabilitet. Proteaser som er involvert i apoptose vil dermed frigjøres fra lysosomer til cytosol. Legumain som befinner seg i lysosomene, kan frigjøres til cytosol og dermed påvirke aktiviteten av caspase-3 eller andre proteaser. Cellene ble stimulert med staurosporin i 0-24 timer. Legumain og caspase-3 aktivitet ble målt. Resultatene viste at caspase-3 aktiviteten økte etter staurosporin behandling i M4C celler. Resultatene på legumainaktivitetsmålingene viste en tendens til at staurosporin har noe reduserende effekt på legumainaktiviteten. Det ble også undersøkt effekten av Leu-Leu-OMe på caspase-3 og legumainaktivitet i HEK293, M38L og M4C celler i 0-24 timer. Det ble observert økt caspase-3 aktivitet i M38L celler. Det ble også utført doserespons med Leu-Leu-OMe med ulike konsentrasjoner inkubert i 4 timer. Caspase-3 aktivitet var økt i M38L celler i alle konsentrasjoner. Immunoblotting viste tilstedeværelse av aktiv form for caspase-3 med molekylvekt på 17 kDa i M38L celler i alle konsentrasjonene, men i HEK293 og M4C celler ble det vist tilstedeværelse av aktiv form for caspase-3 kun i de høye konsentrasjoner. Legumainaktivitetsmålinger viste å være redusert etter stimulering med Leu-Leu-OMe i ulike tider og konsentrasjoner i alle celletyper. Staurosporin og Leu-Leu-OMe påvirker cellene til økt caspase-3 aktivitet, men resultatene tyder på at det skjer via to ulike mekanismer. Dette fordi staurosporin ga høyest caspase-3 aktivitet når det var mye cystatin E/M, men Leu-Leu-OMe ga høyest caspase-3 aktivitet når cellene inneholdt mye legumain (M38L celler). Mekanismene for dette er ukjent og trenger videre studier.