Immunmodulerende polysakkarider fra E.senegalensis, en medisinplante fra Mali brukt mot malaria

Abstract

E.senegalensis er en plante som vokser i det tropiske Vest-Afrika. Den brukes mye i tradisjonell medisin blant annet mot malaria. Ved malaria nedsettes immunsystemet og en immunstimulering kan således gjøre at pasienten føler seg bedre. Flere studier har vist at polysakkarider kan ha immunmodulerende egenskaper. Målet med oppgaven var å isolere polysakkarider fra stammebarken og rotbarken fra E.senegalensis for deretter å undersøke struktur og biologisk aktivitet relatert til immunsystemet. Tørket bark fra stammen og roten ble først ekstrahert med organiske løsningsmidler for å fjerne lavmolekylære og upolare forbindelser. Polysakkaridene ble isolert ved ekstraksjon med 50 % etanol, 50˚C vann og 100˚C vann. Ekstraktene ble dampet inn og frysetørket før de ble applisert på ANX Sepharose 4 Fast Flow ionebytterkolonne. Dette ble gjort for å rense ekstraktet og isolere nøytrale og sure fraksjoner. De sure fraksjonene (EIKS-S-50%EtOH, EIKS-S-50, EIKS-S-100, EIKS-R-50%EtOH, EIKS-R-50 og EIKS-R-100) ble ytterligere separert etter molekylstørrelse på en HiLoad™ 16/600 Superdex™ 200 gelfiltreringskolonne. Fraksjonene fra denne separasjonen ble EIKS-S-50%EtOHG, EIKS-S-50IG, EIKS-S-50IIG, EIKS-S-100G, EIKS-R-50%EtOHG og EIKS-R-100G. Både før og etter ionekromatografi og gelfiltrering ble det utført karbohydratanalyser ved hjelp av metanolyse og påfølgende GC. Fraksjonene fra gelfilteringen ble metylert og bindingsforhold ble kartlagt ved hjelp av GC-MS. Resultatene for GC og GC-MS viste at alle fraksjonene inneholdt monosakkarider og bindingsforhold som er typiske for pektiner. EIKS-S-50IIG, EIKS-R-50G og EIKS-R-100G inneholder trolig flere områder med rhamnogalakturonaner og homogalakturonaner sammenlignet med de andre fraksjonene. Monosakkaridfordelingen tydet på at fraksjonene fra rotbarken inneholdt mer homogalakturonaner, såkalt smooth regions, enn fraksjonene fra stammebarken. Alle fraksjonene så ut til å ha små områder med tett forgrenet RG I. EIKS-R-100G viste størst innhold sammenlignet med de andre fraksjonene. AG-II opptrer som sidekjeder på RG-I. Bindingsforholdene tydet på at det var AG-II strukturer i alle fraksjonene. Særlig EIKS-S-50%EtOHG og EIKS-R-50%EtOHG viste høyt innhold av disse bindingstypene. Komplement fikserings-testen ble benyttet for å kartlegge biologisk aktivitet for fraksjonene. Testen ble utført på råekstraktene og på fraksjonene etter ionebytterkromatografi og gelfiltrering. Bortsett fra EIKS-S-50%EtOH, EIKS-S-50IIG og FIK-R-50 viste alle fraksjonene en høyere komplementfikserende aktivitet enn positiv kontrollen BPII. Alle fraksjonene bortsett fra EIKS-S-50%EtOH ble mer aktive etter opprensning på gelfiltreringskolonnen. Flere av fraksjonene som ble isolert etter ionebytterkromatografi viste derimot lavere komplementfikserende aktivitet enn råekstraktene. Dette kan tyde på at aktive komponeneter har blitt eksludert ved ionebytterkromatografi. EIKS-S-50IG og EIKS-R-50%EtOHG utpekte seg som de mest potente fraksjonene med henholdsvis 49 og 106 ganger høyere komplementfikserende aktivitet enn BPII. Hairy region i pektiner er forbundet med komplementfikserende aktivitet. EIKS-R-50%EtOHG var den fraksjonen som viste best komplementfikserende aktivitet og var en av fraksjonene som tilsynelatende inneholdt mest forgreinede AG-II strukturer . EIKS-S-50IIG så ut til å inneholde minst AG-II av fraksjonene og var den fraksjonen som viste dårligst komplementfikserende aktivitet. For flere av de andre fraksjonene finner man ikke denne sammenhengen. FIK-S-50 og FIK-R-50%EtOH var de mest potente råekstraktene og vil være mest aktuelle å jobbe videre med mot en eventuell improved traditional medicine. FIK-S-50 fra stammebarken vil være den enkleste metoden da det benyttes vann. Bruk av stammebark vil også være mer gunstig for en bærekraftig høsting av plantemateriale enn bruk av rotbark vil.