Abstract
Bakgrunn: CYP3A-enzymene representerer en av de viktigste subfamiliene i metabolisme av
legemidler. CYP3A4 er det CYP-enzymet med generelt høyest konsentrasjon i lever, men hos enkeltpersoner som bærer CYP3A5 villtype-allelet kan uttrykket av CYP3A5 være på samme nivå som CYP3A4. Det er stor strukturell likhet mellom CYP3A4 og CYP3A5, og de
deler også mange substrater. Overlapping i substratspesifisitet er imidertid ikke fullstendig og felles substrater vil ofte ha ulik affinitet for CYP3A4 og CYP3A5. Hensikten med denne
oppgaven var å utvikle og sammenligne in vitro-modellsystemer for å studere metabolisme og hemming via CYP3A4 og CYP3A5.
Metoder: Det ble utviklet en LC/MS-metode for å analyse av hydroksylerte midazolammetabolitter (1-OH-MDZ og 4-OH-MDZ). LC/MS-metoden ble validert med tanke på linearitet, presisjon og nøyaktighet, og benyttet for kvantifisering av metabolittdannelse i
dose-respons-forsøk med midazolam (1-50 μM) i CYP3A4- og CYP3A5-mikrosomer fra rekombinante insektsceller og humane leverceller (THLE). En metode for å kvantifisere CYP3A4/3A5-enzymer ved elektroforese og Western blott ble også satt opp. Standardkurver
av kjente enzymkonsentrajoner (mikrosomer fra rekombinante insektsceller) ble benyttet for å kvantifisere innholdet i THLE-mikrosomer. På grunn av lavt uttrykk av CYP3A5 i THLE-
3A5-mikrosomer ble disse ikke benyttet i metabolismeforsøk med midazolam.
Resultater: Valideringen av LC/MS-metoden viste tilfredstillende verdier for både linearitet,presisjon og nøyaktighet. Dose-respons-forsøkene med midazolam som CYP3A4/3A5 modellsubstans viste fenomenet substrat-hemming for dannelsen av hovedmetabolitten 1-
OH-MDZ i insekt-3A4/3A5-mikrosomer, men ikke THLE-3A4-mikrosomer. Midazolam hadde høyere affinitet (lavere Km-verdi) til insekt-3A5-mikrosomer enn insekt-3A4-mikrosomer.
Samtidig var vmax-verdien dobbelt så høy via insekt-3A5-mikrsomer sammenlignet med insekt-3A4-mikrosomer (basert på 1-OH-MDZ). Både vmax- og Km-verdi for dannelse av 1-OH-MDZ via THLE-3A4-mikrosomer var om lag 5 ganger høyere enn via insekt-3A4-mikrosomer.
Diskusjon og konklusjon: Det ble utviklet metoder for å studere CYP3A-metabolisme av midazolam in vitro. Disse kan blant annet anvendes for å undersøke i hvilken grad substanser hemmer CYP3A4 sammenlignet med CYP3A5. I tråd med tidligere vitro-studier ble det i forsøk med insektsmikrosomer observert en raskere metabolisme av midazolam til
1-OH-MDZ via CYP3A5 enn CYP3A4. Det samme gjaldt fenomenet substrat-hemming, men dette ble ikke observert for CYP3A4-metabolisme i THLE-mikrosomer. vmax- og Km-verdier for dannelse av 1-OH-MDZ via CYP3A4 var for øvrig signifikant forskjellige i insekt- og THLE mikrosomer.
Dette kan indikere ulik konformasjon av CYP3A4 i de to ulike mikrosommodellene.
I så fall betyr det at metabolittdannelsen, og dermed de enzymkinetiske parameterne, vil kunne variere avhengig av hvilken in vitro-modell som benyttes. Siden in vitro-metabolismestudier benyttes til å predikere farmakokinetiske forhold in vivo, bør
framtidig forskning også fokusere på valg av in vitro-metabolismemodell.