Abstract
SAMMENDRAG
Mykofenolat (MPA) inkluderes i de fleste immunsuppressive behandlingsregimer etter organtransplantasjon. UDP-glukuronosyltransferasene (UGT) 1A8 og 1A9 spiller en viktig rolle i metabolismen av MPA. Dannelsen av den inaktive metabolitten mykofenolat 7 glukuronid (MPAG) skjer hovedsakelig via UGT1A9 som uttrykkes i lever, nyre og gastrointestinaltraktus. UGT1A9 viser stor grad av sekvensvariasjon og ulike sekvensvarianter i promoter- og det kodende området er assosiert med endret uttrykk og aktivitet av enzymet. Den genetiske diversiteten i UGT1A9 er en mulig forklaring på de store individuelle forskjellene i MPA-respons, og derfor en potensiell parameter for å individualisere MPA pasientbehandling.
Målet med dette mastergradsprosjektet var å utvikle og validere analysemetoder for UGT1A9 sekvensvariantene c.-2152C>T, c.-275T>A, c. 440C>T og c.-331T>C ved bruk av sanntids-PCR og smeltekurveanalyse med hybridiseringsprober. Videre ønsket vi å benytte metodene til å undersøke sammenhengen mellom genotype og MPA-konsentrasjon blant 32 nyretransplanterte pasienter i en pilotstudie. Formålet var å undersøke om UGT1A9-genotype kan være en potensiell parameter for å predikere grad av MPA eksponering hos pasienter som får fast dose MPA.
Genotyping ble utført ved sanntids-PCR og smeltekurveanalyse med allelspesifikke hybridiseringsprober på LightCycler® 480 instrument (Roche, Tyskland). PCR-primere og prober ble designet og vurdert ved bruk av blant annet LC Probe Design Software, BLAST, OLIGO and SNPCheck. Metodene ble validert med hensyn på parametre som sensitivitet, spesifisitet og robusthet.
De etablerte og validerte metodene for deteksjon av UGT1A9-sekvensvariantene c.-2152C>T c.-275T>A, c. 440C>T og c. 331T>C ble benyttet til å genotype 100 kontrollindivider og 100 nyretransplanterte pasienter, inkludert 32 pasienter fra en pilotstudie.
Smeltepunktsanalyse, gelelektroforese og sekvensering bekreftet sensitiv og spesifikk deteksjon av sekvensvariantene. Metodene påvirkes ikke av forskjeller i DNA-konsentrasjon (>0,06 ng/µL), eller oppbevaring under ulike betingelser (<4 uker, 4-37 ⁰C).
Allelfrekvens for UGT1A9 c.-2152C>T og c.-275T>A varierte fra 5-17 % mellom kontrollindividene (n=100) og de nyretransplanterte pasientene (n=32). De samme pasientene var hhv. villtype, homozygot eller heterozygot for de to sekvensvariantene. Det var også full korrelasjon mellom sekvensvariantene UGT1A9 c. 440C>T og c.-331T>C. For disse sekvensvariantene varierte allelfrekvensen fra 23-24 % mellom pasientene (n=32) og kontrollindividene (n=100) (Tabell 7).
Vi observerte tendens til høyere glukuronideringsaktivitet hos pasienter med UGT1A9 variantene c.-2152C>T og c.-275T>A, og en redusert glukuronideringsaktivitet hos pasientene med UGT1A9 c.-440C>T og c.-331T>C sammenlignet med de som ikke hadde noen av sekvensvariantene. MPA C0-verdiene tyder på at UGT1A9 c.-2152C>T og c.-275T>A har størst betydning for konsentrasjonen av MPA. Det var imidlertid ingen signifikant assosiasjon mellom haplotype og MPA C0-verdier (Mann-Witney-U-test, signifikansnivå 5 %). På grunn av det lave pasientantallet og få kinetikkdata (MPA C0) kan vi ikke trekke noen endelig slutning ut fra observasjonene våre. Tendensen vi ser i resultatene stemmer imidlertid godt med det som er rapportert i flere andre studier.1-3
Farmakogenetiske analyser av blant annet UGT1A9-sekvensvarianter kan bidra til å øke kunnskapen rundt de inderindividuelle forskjellene i farmakokinetikken til MPA og potensielt være en parameter for individualisering av MPA-behandling. Klinisk nytteverdi av farmakogenetiske analyser, deriblant av UGT1A9-sekvensvarianter, må imidlertid dokumenteres ytterligere i flere studier som inkluderer større populasjoner og utvidede MPA-kinetikkmålinger før genoyping kan brukes til å styre MPA-behandling.