Subkloning og proteinanalyser av rGH-varianter i MDCK II-celler

Abstract

Epitelcellelinjen ”Madin-Darby canine kidney” (MDCK), er en velstudert polarisert cellelinje som danner et tett cellelag med separate apikale og basolaterale membranoverflater. For å opprettholde polariteten, må nysyntetiserte proteiner og lipider fraktes til sine respektive membrandomèner ved hjelp av et sorterings- og transportmaskineri. N-glykosylering er kritisk i foldings- og sorteringsprosessen for mange proteiner. Glykosaminoglykaner (GAG) antas også å kunne medvirke i sorteringsprosesser. I denne oppgaven ble polariserte MDCK II-celler brukt til å studere betydningen av ulike karbohydratmodifiseringer på sortering og transport av modellproteinet rotte veksthormon (rGH) med et C-terminalt grønt fluorescerende protein (GFP). rGH er vanligvis et ikke-glykosylert protein, som blir skilt ut omtrentlig like mye til hver side når det uttrykkes i polariserte MDCK-celler.

De forskjellige rGH-variantene ble radioaktivt metabolsk merket med radioaktiv-sulfat, -cystein/metionin eller -glukosamin og immunpresipitert fra apikalt og basolateralt medium. rGH med innsatte Ser-Gly seter ble modifisert med CS-kjeder. Dette er tidligere ikke vist at enkle Ser-Gly seter i et rekombinat protein kan modifiseres med GAG-kjeder. rGH:GFP modifisert med kondroitinsulfat (CS) og N-glykaner, ble hovedsakelig sortert til den apikale siden (74%), mens CS-kjedene på rGH utskilt i basolateralt medium var mest sulfaterte. rGH:GFP modifisert kun med N-glykaner ble hovedsakelig sortert til den apikale siden. N-glykanene på begge variantene av rGH ble sulfatert og dette reiser spørsmål om hvor omfattende sulfatering av N-glykaner er, og om dette kan ha en betydning for sortering av glykoproteiner.