Abstract
Humane cellers respons på stråling er avhengig av doseraten som strålingen leveres med. I denne oppgaven har en human cellelinje, T98G, blitt bestrålt med lave doserater for å finne effekten av strålingen ved bestrålingstider på flere uker.
Strålingen ble levert ved at en viss mengde av den radioaktive isotopen [3H] (tritium) ble bundet til den essensielle aminosyren valin og inkorporert i cellenes protein. Dosimetri- og effektforsøk ble først utført med spesifikk aktivitet på 1.67 μCi/ml i mediet. Celle- og kjernediametrene til cellene ble funnet ved hjelp av fasekontrastmikroskopiske undersøkelser. Den gjennomsnittlige cellediameteren ble funnet til å være 20.66 ± 0.622 μm, med tilhørende kjernediameter på 11.11 ± 0.182 μm. Doseraten til cellekjernen ble beregnet ut fra en modell for cellulær tritiumdosimetri utviklet av Goddu et al. (Goddu, Howell et al. 1997), og ble funnet å være 0.0525 ± 0.01 Gy/time.
Doblingstiden til cellene ble deretter bestemt for celler som vokste på medium med forskjellig spesifikk aktivitet av [3H]-valin (0.27, 0.53, 1.67, 6.5 og 19.5 μCi/ml) og for ubestrålte kontrollceller som vokste på medium tilsatt ikke-radioaktiv valin. Det ble utført forsøk for å finne doblingstiden den første uken etter inkorporeringen av [3H]-valin, i tillegg til at det for cellene som hadde vokst på radioaktivt medium med spesifikk aktivitet på 6.5 μCi/ml ble utført forsøk for å finne doblingstiden også etter 7 dager på radioaktivt medium. Doblingstidene for de to laveste doseratene så ut til å være noe kortere enn for den ubestrålte kontrollen, mens det for cellene som vokste på radioaktivt medium på 6.5 μCi/ml så ut til å ha en noe lengre doblingstid. Imidlertid var ingen av disse forskjellene i doblingstid signifikante. Den høyeste doseraten, svarende til en spesifikk aktivitet på 19.5 μCi/ml, resulterte i en kraftig økning i doblingstid etter 4 dager på radioaktivt medium, og etter 7 dager på radioaktivt medium var doblingstiden mer enn doblet i forhold til den ubestrålte kontrollen.
Cellesyklusfordelingen til de bestrålte cellene ved to ulike tidspunkter i bestrålingsperioden ble funnet ved hjelp av flowcytometri. For de tre laveste doseratene ble det ikke observert noen tydelig endring i cellesyklusfordelingen i forhold til den ubestrålte kontrollen. Cellene som vokste på radioaktivt medium med spesifikk aktivitet på 6.5 μCi/ml viste en akkumulering av celler i G2-fasen etter 11 dager, da fraksjonen av celler i G2-fasen var omtrent doblet i forhold til den ubestrålte kontrollen. Endringen i cellesyklusfordelingen var enda mer tydelig for cellene som vokste på radioaktivt medium med spesifikk aktivitet på 19.5 μCi/ml, hvor fraksjonen av celler i G2-fasen etter 7 dager var omtrent firedoblet i forhold til den ubestrålte kontrollen.
Det ble utført celleoverlevelsesforsøk for bestrålingstider opp til 45 uker for celler som vokste på [3H]-medium med spesifikk aktivitet på 0.27, 0.53, 1.67, 6.5 og 19.5 μCi/ml. Celleoverlevelsesforsøkene viste at cellene tolererte bestrålingen med de to laveste doseratene gjennom hele bestrålingsperioden. For cellene som vokste på radioaktivt medium med spesifikk aktivitet på 6.5 og 19.5 μCi/ml ble det observert en stor endring i celleoverlevelse, ogt overlevelsesfraksjonen sank til under 0.1 % etter hhv. 3 og 18 dager. Cellene som vokste på [3H]-medium med spesifikk aktivitet på 1.67 μCi/ml opplevde et kraftig fall i overlevelsesfraksjon, før overlevelsesfraksjonen steg igjen og stabiliserte seg på 50-60 % relativt til en ubestrålt kontroll. Denne overraskende utviklingen kunne tyde på en adaptasjon til lavdoseratebestrålingen, muligens grunnet en seleksjonsprosess. Flowcytometriforsøk utført på disse cellene viste at de hadde endret sin ploiditet, ved at de hadde et lavere DNA-innhold enn villtypen av T98G-cellene.
Det ble videre utført akuttbestrålingsforsøk på disse cellene. Etter at cellene hadde vokst på [3H]-medium med spesifikk aktivitet på 1.67 μCi/ml i 11 måneder, ble de gitt akutte stråledoser ved bruk av 220 kV røntgenstråling. Doseraten som ble levert ved røntgenbestrålingen ble, ved hjelp av ESR-dosimetri, funnet å være 0.272 ± 0.005 Gy/min, og cellene ble gitt doser på 0.11, 0.54, 1.09, 2.72, 4.89 og 6.52 Gy. For villtypen av T98G-cellene kunne det for de aller laveste dosene observeres en antydning til hypersensitivitet ved den laveste dosen som ikke kunne ses hos cellene som hadde gått på [3H]-medium med spesifikk aktivitet på 1.67 μCi/ml forut for akuttbestrålingen. Det så i tillegg ut til at overlevelsesfraksjonen for de lavdoseratebestrålte cellene lå noe høyere enn for villtypen. Imidlertid tyder p-verdiene på at det ikke er noen signifikant forskjell i celleoverlevelse for kontrollcellene og cellene som hadde blitt lavdoseratebestrålt i 10 måneder før akuttbestrålingen.
The response of human cells to radiation is dependent on the dose rate at which the radiation is delivered. In the present study, the T98G human glioblastoma cell line was exposed to low dose-rate irradiation with the purpose of determining the effect of the irradiation after exposure times of several weeks.
The radiation dose was delivered to the cells by adding a fraction of the radioactive isotope [3H] (tritium) to the growth medium of the cells. [3H] was bound to the essential amino acid valine, which was incorporated into the cellular proteins. The dose rate to the nucleus was calculated using a model for cellular tritium micro dosimetry, developed by Goddu et al (Goddu, Howell et al. 1997). The cell and nucleus diameter was found using phase-contrast microscopic techniques. The calculated mean cell diameter was found to be 20.66 ± 0.622 μm, with a mean nucleus diameter of 11.11 ± 0.182 μm. An initial medium specific activity of 1.67 µCi/ml resulted in a dose-rate to the T98G-nucleus of 0.0525 ± 0.01 Gy/h.
The mean doubling time was determined for unirradiated cells growing in medium containing non-radioactive valine and for cells growing on radioactive medium with different specific activities of [3H]-valine (0.27, 0.53, 1.67, 6.5 and 19.5 μCi/ml). An experiment was performed to determine the doubling time for the irradiated cells the first week after the incorporation of [3H]-valine, and for the cells growing in medium with the highest specific activity (19.5 μCi/ml), was also performed an experiment to determine the doubling time 7 days after the incorporation of [3H]-valine. The calculated mean doubling time for the irradiated cells growing in medium giving the two lowest dose rates (with specific activities of 0.28 and 0.53 μCi/ml) appeared to be slightly shorter than the doubling time for the unirradiated cells, although not significant, whereas for cells growing in [3H]-medium with a specific activity of 1.67 μCi/ml there did not seem to be any difference in doubling time. The highest dose rate, delivered by [3H]-medium with a specific activity of 19.5 μCi/ml, resulted in a significant increase in the mean doubling time 4 days after the incorporation of [3H]-valine, and 7 days after the incorporation of [3H]-valine, the mean doubling time was twice as high as the mean doubling time for the unirradiated cells.
The cell cycle distribution was found for unirradiated cells growing in medium containing non-radioactive valine and cells growing in radioactive medium with different specific activities of [3H]-valine (0.27, 0.53, 1.67, 6.5 and 19.5 μCi/ml) using flow cytometry. For the cells growing in medium giving the three lowest dose rates (with specific activities of 0.28, 0.53 and 1.67 μCi/ml), no changes in cell cycle distribution were observed. The cells growing in [3H]-medium with specific activity of 6.5 μCi/ml showed an accumulation of cells in the G2-phase of the cell cycle after 11 days, at which time the fraction of cells in the G2-phase was almost doubled compared to the unirradiated cells. The change in cell cycle distribution was even more pronounced for cells growing in [3H]-medium with specific activity of 19.5 μCi/ml, where the fraction of cells in the G2-phase was 4 times as large as for the unirradiated cells.
In the cellular survival experiments performed in this work, the survival of cells irradiated with the use of different [3H]-medium specific activities (0.27, 0.53, 1.67, 6.5 and 19.5 µCi/ml) for irradiation times up to 45 weeks was measured. The cell survival experiments showed that the cells tolerated the two lowest dose rates throughout the irradiation period. For cells growing in [3H]-medium with a specific activity of 6.5 and 19.5 μCi/ml, the surviving fraction changed dramatically, and dropped below 0.1 % after 3 and 18 days, respectively. The cells growing in [3H]-medium with a specific activity of 1.67 μCi/ml experienced an initial rather dramatic decline in cell survival, before the surviving fraction increased and stabilized at 50-60 % compared to the unirradiated cells. This rather surprising development with a steep decline in clonogenic ability followed by a more radioresistant phase suggests an adaption to the low dose rate irradiation, possibly due to a selection process. Flowcytometric experiments performed on these cells showed that they had an altered ploidity with a lower DNA content compared to the unirradiated T98G cells.
After an irradiation period of 11 months (with the use of [3H]-medium with specific activitiy of 1.67 µCi/ml), the cells were given acute radiation doses using 220 kV X-rays. The dose rate was found to be 0.272 ± 0.005 Gy/min using EPR-spectoscopy, and the cells were given doses of 0.11, 0.54, 1.09, 2.72, 4.89 and 6.52 Gy. For the lowest dose given, the wildtype T98G cells demonstrated low dose hyper radiosensitivity. This increased radiosensitivity was not observed for the cells growing in [3H]-medium with specific activity of 1.67 μCi/ml for 11 months prior to the experiment. It appears that the surviving fraction of the cells given continuous low dose radiation for 11 months prior to the acute irradiation is slightly higher than that of normal T98G cells. However, the p-values indicated no significant difference.